微生物・発酵（大腸菌）の工程チェックリスト
検討する工程に印を付けて、規模と用途を書けば、仕様メモにして代理店やメーカーへ渡せます。工程ごとの詳しい説明は工程マップにあります。
2規模と用途
3検討する工程に印を付ける25 / 25 工程
培養・産生
1セルバンク構築
株の均一性がロット間の発現量と不純物プロファイルのぶれを左右する。
- 基準の方法
- BL21(DE3)系株＋T7/pET発現系でのセルバンク化（MCB/WCB二段階）
- ほかの方法
- プロテアーゼ欠損ベース株（毒性/分解性タンパク向け）・ペリプラズム分泌発現・汎用K-12宿主（医薬グレード由来株）
2種培養・植菌スケールアップ
凍結セルバンクから生産槽へ十分量の活性菌体を供給する標準の前段拡大
- 基準の方法
- WCBバイアル起眠→振とうフラスコ前培養→種発酵槽での対数増殖期植菌（約5〜10%接種）
- ほかの方法
- シングルユース・シード拡大・高密度バイアルからの単段植菌（HDCB）
3培地調製・滅菌
高密度培養前に無菌の培地・流加フィードを供給し汚染を防ぐ標準前工程
- 基準の方法
- バッチ培地のSIP（121°C・30分相当）＋高濃度グルコースフィードの0.2µm除菌ろ過と無菌移送
- ほかの方法
- オートクレーブ滅菌（小規模・ガラス容器）・事前γ線滅菌シングルユース容器＋全フィード除菌ろ過
4高密度流加培養による菌体増殖
酢酸蓄積を抑えつつ菌体密度を上げ、目的物の総量を最大化する。
- 基準の方法
- グルコース制限流加培養（指数流加＋DO-stat制御）
- ほかの方法
- pH-stat 流加培養・回分（batch）培養・ロッキングモーション型培養
5IPTG誘導
誘導のタイミングと量が毒性と収量を決める分岐点。
- 基準の方法
- IPTGによるT7/lacプロモーター誘導（温度・濃度を最適化）
- ほかの方法
- ラクトース誘導／自己誘導（オートインダクション）・アラビノース誘導（araBAD/pBAD系）
回収・清澄化
6ハーベスト・破砕
封入体を壊しすぎず菌体内の目的物を取り出せるかが後工程の鍵。
- 基準の方法
- 遠心/精密ろ過で菌体回収後、高圧ホモジナイザーで破砕
- ほかの方法
- マイクロフルイダイザー（複数回循環）・超音波破砕（ラボ規模）・化学的/酵素的溶菌
7IB洗浄
可溶化前の封入体純度が後の巻き直しの成否を左右する。
- 基準の方法
- 遠心によるIBペレット化＋界面活性剤/低濃度尿素での洗浄
- ほかの方法
- デプスフィルター/精密ろ過によるIB回収・洗浄回数・界面活性剤種の最適化
8封入体の可溶化
ほどき具合のバランスが溶解性と巻き直し収率を決める。
- 基準の方法
- 高濃度カオトロープ（尿素/塩酸グアニジン）＋還元剤での可溶化
- 代表的なメーカー
- MerckSartoriusSigma-Aldrich
- ほかの方法
- マイルド可溶化（低濃度カオトロープ＋pH）・アルカリpH/n-ラウロイルサルコシン可溶化・高圧（high pressure）可溶化
精製
9リフォールディング（巻き直し）
凝集を防ぎ正しいジスルフィドを作り活性を取り戻す律速工程。
- 基準の方法
- 急速希釈／拡散ろ過による段階的変性剤除去＋酸化還元対でのジスルフィド再形成
- ほかの方法
- オンカラムリフォールディング（SEC/IEX/固定化）・拡散ろ過による変性剤除去・高圧リフォールディング
10清澄化・濃縮
希釈リフォールド液の大容量を凝集体除去・濃縮し捕捉クロマトに供する
- 基準の方法
- pH調整による反応停止→デプス＋0.2µmろ過で凝集体除去→TFF限外ろ過で濃縮
- 試薬・資材
- バッファ調製（バッファ供給システム）
- ほかの方法
- 遠心による凝集体除去＋限外ろ過濃縮・拡張床吸着（EBA）で清澄化と捕捉を一体化
11キャプチャー
大量の不純物を一度に削る最初の濃縮・精製ステップ。
- 基準の方法
- イオン交換クロマトグラフィー（IEX）またはアフィニティ（His-tag等）による捕捉
- 代表的なメーカー
- Cytiva
- ほかの方法
- 固定化金属アフィニティ（IMAC, His-tag）・混合モードレジンによる捕捉
12ポリッシング
凝集体・断片と内毒素を削り最終純度と安全性を決める。
- 基準の方法
- 疎水性相互作用（HIC）／陰イオン交換（AEX）による別系統のポリッシュ＋内毒素除去
- ほかの方法
- サイズ排除（SEC）ポリッシュ・セラミックハイドロキシアパタイト（CHT）・内毒素除去専用リガンド
13エンドトキシン除去
大腸菌由来LPSを規格値まで低減する大腸菌製品に必須の除去工程
- 基準の方法
- Q強陰イオン交換樹脂によるフロースルーモードでのLPS除去（製品は素通り、LPSは樹脂に吸着）
- ほかの方法
- Triton X-114 温度誘起二相分配・LPSアフィニティ樹脂（ポリミキシンB）による吸着除去
製剤・充填
14UF/DF・バッファ交換
目的物を必要濃度まで濃縮し保存用バッファへ交換する最終仕上げ。
- 基準の方法
- タンジェンシャルフロー限外ろ過/拡散ろ過（TFF UF/DF）
- ほかの方法
- シングルパスTFF（SPTFF）・透析
15除菌ろ過と無菌充填
微生物を除き無菌の注射剤に仕上げる最後の安全性の関門。
- 基準の方法
- 0.22 µm除菌ろ過後の無菌充填（バイアル/シリンジ）
- 試薬・資材
- 添加剤・安定化剤（製剤用エクシピエント）
- ほかの方法
- 凍結乾燥（フリーズドライ）・0.45/0.22 µm 二段ろ過
16バイオバーデン低減ろ過
除菌ろ過前にバイオバーデンと微粒子を下げ無菌充填の信頼性を担保
- 基準の方法
- 充填前バルクの0.45/0.22µm前置（バイオバーデン低減）ろ過
- 試薬・資材
- 製剤バッファ（充填前バルク）
- 代表的なメーカー
- MerckSartoriusMerck Millipore
- ほかの方法
- 中間ホールド前後のバイオバーデンサンプリング＋単層0.2µm・低温ホールドで増殖抑制し前置ろ過を簡略化
品質特性・分析
17製品力価・含量（タンパク質定量）
目的物の量を数値化し工程管理とロット規格の基本データとする。
- 基準の方法
- 逆相/SEC-HPLCまたはUV(A280)による定量＋プロセス内はBradford/BCA
- ほかの方法
- Bradford/BCAアッセイ・A280（吸光係数換算）・SDS-PAGE＋Western blot
18純度・凝集体/断片
免疫原性に直結する凝集体・断片の混入量を別の方法で評価する。
- 基準の方法
- SEC-HPLC（サイズ排除）＋CE-SDS（還元/非還元）による純度評価
- ほかの方法
- SEC-MALS（多角度光散乱）・分析用超遠心（AUC）・SDS-PAGE（還元/非還元）
19純度・電荷不均一性
脱アミドや切断による電荷変化を捉え製造のばらつきを管理する。
- 基準の方法
- イメージドキャピラリー等電点電気泳動（icIEF）／IEX-HPLC
- 試薬・資材
- 両性担体・pIマーカー（IEF試薬）
- ほかの方法
- IEX-HPLC（陽/陰イオン交換）・従来型cIEF/IEF-ゲル
20同一性・分子量
分子量と配列・修飾を精密確認し目的物であることを保証する。
- 基準の方法
- インタクト質量分析
- ほかの方法
- N末端配列（エドマン分解）・ジスルフィド結合マッピング（非還元ペプチドマップ＋MS）・アミノ酸組成分析
21高次構造解析
正しく折りたたまれ高次構造が保たれているかが効力を左右する。
- 基準の方法
- 円二色性（CD）分光＋蛍光分光による構造確認
- 試薬・資材
- 希釈バッファ（CD用に低吸収のリン酸塩/フッ化物系、Cl-を避ける）、参照標準
- ほかの方法
- 示差走査蛍光定量（DSF/nanoDSF）・FTIR分光・HDX-MS（水素重水素交換）
22力価試験
効く力の有無を機能で測り製品成立の可否を決める。
- 基準の方法
- 製品依存の機能アッセイ（細胞ベースバイオアッセイ／酵素活性／結合アッセイ）
- ほかの方法
- 酵素活性アッセイ（比活性）・ELISA系結合アッセイ・レポーター遺伝子細胞アッセイ
23HCP測定
E. coli由来混入タンパク質は微量でも免疫原性・安定性に影響する。
- 基準の方法
- サンドイッチELISAによるE. coli HCP定量
- 装置
- プレートリーダー
- 試薬・資材
- 宿主細胞タンパク質（HCP）ELISA
- 代表的なメーカー
- Cygnus TechnologiesGyros Protein TechnologiesMolecular DevicesTecanBioTek
- ほかの方法
- LC-MS/MSによるHCP同定・定量・2D-DIGE/2D電気泳動
24残存DNA測定
宿主DNA残量は規制で上限が定められた安全性必須項目。
- 基準の方法
- リアルタイムqPCR（TaqMan）によるE. coli残存DNA定量
- 試薬・資材
- 残存宿主細胞DNA（qPCR/dPCR）
- 代表的なメーカー
- Bio-RadThermo FisherApplied Biosystems
- ほかの方法
- 蛍光色素（インターカレーター）法・デジタルPCR（dPCR）
25エンドトキシン試験
E. coli由来内毒素は発熱・ショックを起こすため限度内を必ず確認する。
- 基準の方法
- LAL法による細菌内毒素試験（BET）
- 試薬・資材
- Charles River Endosafe LAL カートリッジ（カブトガニ由来アメボサイトライセート、発色基質内蔵）、内毒素標準（CSE, control standard endotoxin）
- 代表的なメーカー
- LonzaCharles River
- ほかの方法
- 組換えファクターC（rFC）法・ゲル化（gel-clot）LAL・単球活性化試験（MAT）
25工程を選んでいます。仕様メモでは、宛先・条件・確認したいことを書き足して、PDF やメールで渡せます。
選んだ25工程で仕様メモを作る公開情報にもとづく一般的な整理です。基準の方法とメーカーは代表例で、推薦ではありません。実際に要る工程と装置は、規模と規制の方針で変わります。