遺伝子治療（AAVベクター）の工程チェックリスト
検討する工程に印を付けて、規模と用途を書けば、仕様メモにして代理店やメーカーへ渡せます。工程ごとの詳しい説明は工程マップにあります。
2規模と用途
3検討する工程に印を付ける29 / 29 工程
細胞・産生
1セルバンク調製・凍結保存
MCB/WCBの二層保存と緩慢凍結・気相液窒素保管が製造の再現性を担保する起点
- 基準の方法
- GMP対応の MCB/WCB 二層式構築
- ほかの方法
- パッシブ凍結・機械式超低温保管・DMSOフリー/低毒性凍結
2セルバンク特性解析・安全性試験
無菌・マイコ・同定・外来性ウイルス・遺伝安定性で細胞バンクの適格性を裏づける
- 基準の方法
- ICH Q5D に基づく MCB/WCB 特性解析パッケージ
- ほかの方法
- マイコプラズマNAT・外来性ウイルス（NGS/in vitro）・細胞同定
3原料プラスミド受入・適格性確認
プラスミドは製品DNAそのものになる出発材料で品質が力価と安全性を直接左右するため
- 基準の方法
- アガロースゲル電気泳動／CGEによるトポロジー
- 装置
- CGEトポロジー解析：Agilent 5200 Fragment Analyzer（dsDNA分離キャピラリーアレイ）。エンドトキシン：Charles River Endosafe nexgen-PTS（カートリッジ式LAL）。アガロースゲル：Bio-Rad サブセル GTシステム＋ChemiDoc。
- 試薬・資材
- Agilent Fragment Analyzer dsDNA 915 Reagent Kit（分離ゲル・サイズマーカー・インターカレート色素）。Endosafe LAL カートリッジ（Charles River、感度0.05〜5 EU/mL）。プラスミド標準品（自社リファレンス）。アガロース・TAE/TBEバッファ。
- 代表的なメーカー
- Bio-RadAgilentCharles RiverPacBioOxford Nanopore
- ほかの方法
- アニオン交換HPLCトポロジー・残存宿主DNA・カナマイシン耐性遺伝子定量・ITR/全長配列確認NGS
4シードトレイン・N-1スケールアップ
トランスフェクション直前の生存率・密度・細胞齢をそろえ生産槽へ供給するシードトレイン
- 基準の方法
- 化学的定義
- 試薬・資材
- HEK293／ウイルスベクター用培地
- ほかの方法
- 灌流による高細胞密度シードトレイン・オービタルシェイク拡大・マイクロキャリア接着系拡大
5産生プラットフォーム選定
細胞基質×ゲノム導入方式の選択が精製設計・収量・COGS・規制説明を一括で規定する
- 基準の方法
- 浮遊馴化HEK293細胞の無血清浮遊培養＋一過性トリプルトランスフェクション
- 代表的なメーカー
- CytivaSartoriusPallThermo FisherPolyplus
- ほかの方法
- Sf9/バキュロウイルス系・誘導型/安定プロデューサー細胞株・固定床バイオリアクター
6トランスフェクション基準法
PEIによる3プラスミド導入の効率と複合体設計が収量と空実比を左右する中心工程
- 基準の方法
- 浮遊HEK293
- 試薬・資材
- PEIpro（トランスフェクション試薬）プラスミド（pHelper／pRepCap／pITR）
- 代表的なメーカー
- CytivaSartoriusSigma-AldrichPolysciencesPolyplus
- ほかの方法
- FectoVIR-AAV大規模トランスフェクション・PEI MAXトリプルトランスフェクション・リン酸カルシウム共沈法
精製
8ハーベスト・細胞溶解
細胞内に蓄積したAAVを界面活性剤溶解で取り出す、回収率を左右する律速工程
- 基準の方法
- 界面活性剤（非イオン性サーファクタント）による化学的細胞溶解
- 試薬・資材
- Triton X-100Tween 20（Polysorbate 20）MgCl2NaCl
- ほかの方法
- 分泌型回収（溶解レス）・機械的溶解・高塩溶解
9ヌクレアーゼ処理・清澄化
ヌクレアーゼでhost DNAを切り粘度を下げ、2段デプスろ過で捕捉前の負荷を除く
- 基準の方法
- エンドヌクレアーゼ消化＋2段（一次・二次）デプスろ過による清澄化
- 試薬・資材
- Benzonase endonuclease（ヌクレアーゼ）MgCl2（補助剤）Triton X-100（界面活性剤）
- ほかの方法
- 塩耐性エンドヌクレアーゼ高塩消化・クロマトグラフィー清澄化・TFDF清澄化
10キャプチャー精製
アフィニティ捕捉で微量カプシドを純度90%超に濃縮し後段AEX・TFFの負荷を下げる
- 基準の方法
- ラクダ科単一ドメイン抗体フラグメント
- 代表的なメーカー
- CytivaSartoriusThermo Fisher
- ほかの方法
- AVB Sepharose系VHH捕捉・セロタイプ特異VHH/合成リガンド樹脂・非アフィニティ捕捉
11空/実分離ポリッシング
封入DNAの微小電荷差をAEX塩グラジエントで使い、実カプシドを濃縮し空を除く研磨工程
- 基準の方法
- 陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)による塩グラジエント溶出での空/実キャプシド分離
- 試薬・資材
- 平衡/結合緩衝液（Bis-Tris／Tris）溶出用塩（NaClグラジエント）ポロキサマー188
- 代表的なメーカー
- Sartorius BIA SeparationsCytivaSartoriusThermo FisherPall
- ほかの方法
- AEXメンブレンフロースルー・二段（2パス）AEX戦略・アフィニティ統合full濃縮
12UF/DF・0.2µmろ過
UF/DFでAAVを膜上に残し濃縮と製剤バッファ置換を同時に行い0.2µmろ過で原薬化
- 基準の方法
- シングルパス／循環式TFFによるUF/DF（限外ろ過・ダイアフィルトレーション）での濃縮・バッファ交換
- ほかの方法
- 中空糸TFF・平膜カセットTFF・シングルパスTFF（SPTFF）
13最終除菌ろ過
低濃度AAVの膜吸着で力価30〜40%を失うため低吸着膜で無菌性とロス抑制を両立
- 基準の方法
- 0.22µm滅菌グレード・低タンパク吸着膜による滅菌ろ過
- ほかの方法
- 0.2µm PES二層滅菌ろ過・フィルタープリコンディショニング/飽和ろ過・ろ過なしクローズド無菌処理
製剤・充填
14フィル＆フィニッシュ・無菌充填
除菌ろ過後の製剤を実際に最終容器へ無菌で充填・閉塞しなければ製品が完成しないため
- 基準の方法
- 単回使用アイソレータ内でぜん動ポンプ式無菌充填・打栓を行い、別チャンバで巻締するシングルユース充填ライン
- 装置
- Cytiva Microcell Vial Filler（クローズド・グローブレス無菌充填アイソレータ、ぜん動ポンプ式、2R〜50R、1.0〜50mL）または Cytiva SA25 Aseptic Filling Workcell（旧Vanrx、2021年Cytiva傘下、グローブレス・ロボット充填アイソレータ）。Optima Pharma のロボット式無菌充填機を採用する例もある。巻締：別チャンバの単回使用キャッパ。
- 試薬・資材
- ガンマ線滅菌済み単回使用充填チューブ／ノズルアッセンブリ（Cytiva/Sartorius シングルユースフローパス）、滅菌済みISOガラスバイアル（Schott/SGD）、ゴム栓（West Pharmaceutical FluroTec）、アルミキャップ（West/Datwyler）。
- ほかの方法
- RABS充填・プレフィルドシリンジ充填・単回使用充填アッセンブリ
15製剤・処方設計
ポロキサマー188と高イオン強度・糖で容器吸着90%損失と血清型依存の凝集を抑える処方
- 基準の方法
- 非イオン界面活性剤ポロキサマー188
- ほかの方法
- 界面活性剤をPS80/PS20に変更・糖/ポリオール主体安定化・pH・イオン強度最適化
16原薬の凍結保存
−60℃以下保存に界面活性剤・糖・低吸着容器を組み凍結ストレスのカプシド破裂を防ぐ
- 基準の方法
- -60〜-80℃の超低温フリーザー（メカニカル式）での凍結保存
- 試薬・資材
- ポロキサマー188（界面活性剤）スクロース（凍結保護剤）L-ヒスチジン緩衝剤リン酸緩衝（DPBS）
- ほかの方法
- LN2気相クライオ保存・凍結乾燥固体化保存・2〜8℃冷蔵短期保存
17コールドチェーン輸送
出荷から投与まで−60℃以下を維持し凍結融解によるカプシド破裂・凝集・力価低下を防ぐ
- 基準の方法
- ドライアイス（固体CO2、約-78.5℃）梱包による-60℃以下維持輸送
- 装置
- バリデート輸送容器（断熱パッシブシッパー）温度データロガーLN2気相シッパー
- 試薬・資材
- ドライアイス液体窒素
- ほかの方法
- LN2ドライ気相クライオシッパー・2〜8℃冷蔵バリデート輸送
キャラクタリゼーション
18ベクターゲノム力価／ddPCR
ddPCRでvgを絶対定量し用量・空実比・ロット均一性を決める全CQAの起点となる分母
- 基準の方法
- デジタルPCR（ddPCR）による絶対定量
- 試薬・資材
- ddPCRスーパーミックス（プローブ用）TaqManプローブ（FAM/HEX標識）ITR/導入遺伝子特異的プライマーDNase I
- 代表的なメーカー
- Bio-RadApplied Biosystems
- ほかの方法
- 定量PCR（qPCR）・UV吸光ゲノム力価推算・CDMS（電荷検出MS）
19総カプシド力価・実/空比／SV-AUC
SV-AUCで総粒子数と空カプシド割合を測りvg/cp比という品質指標を押さえる工程
- 基準の方法
- 沈降速度分析超遠心（SV-AUC）
- 試薬・資材
- ラベルフリー（標識不要・UV吸光検出）解析ソフト（SEDFIT／UltraScan）
- 代表的なメーカー
- Beckman CoulterRefeyn
- ほかの方法
- 総カプシドELISA・マスフォトメトリー・AEX-HPLC
20空/実/部分カプシド比／SV-AUC
沈降係数差で空・部分・実を分け、力価・用量設計・安全性を決めるCQAを絶対定量
- 基準の方法
- 沈降速度分析超遠心
- 装置
- 分析超遠心装置（吸光・干渉光学系搭載）c(s)解析ソフト
- 試薬・資材
- ローターサンプルセクター用緩衝液
- 代表的なメーカー
- Beckman CoulterRefeyn
- ほかの方法
- マスフォトメトリー（MP）・AEX-HPLC/UPLC・CDMS/ネイティブMS
21ゲノム完全性／CGE-LIF
封入ゲノムの全長性をCGE-LIFで評価、切断種が発現不全と免疫リスクを生むため
- 基準の方法
- 変性条件下キャピラリーゲル電気泳動＋レーザー誘起蛍光検出
- 試薬・資材
- ベンゾナーゼ（ヌクレアーゼ）プロテイナーゼKグアニジン塩酸（DNA精製）インターカレート系蛍光色素
- ほかの方法
- PacBio SMRT/HiFi長鎖シーケンス・デュプレックス/マイルポストddPCR・アルカリ変性アガロースゲル
22VP1:VP2:VP3比／CE-SDS
CE-SDSでVP1:VP2:VP3比を測り、カプシド組立とトランスダクション効率を監視する
- 基準の方法
- CE-SDS（ドデシル硫酸ナトリウム キャピラリー電気泳動、UV吸収検出）
- 試薬・資材
- SDS-MWゲルバッファSDS内部標準還元剤
- ほかの方法
- 逆相LC-UV/RP-UPLC・SDS-PAGEデンシトメトリ・RP-LC-MS
23カプシド同定・PTM解析／LC-MS
LC-MS/MSで血清型VP配列の同一性と導入効率に効くPTMを部位ごとに特性解析する
- 基準の方法
- LC-MS/MS
- 試薬・資材
- RP用C4/C18カラムHILICカラム消化酵素（トリプシン）変性・還元アルキル化試薬（DTT/IAA）
- ほかの方法
- インタクトVPのRP-LC-MS・ネイティブ質量分析・MS/MSによる末端・配列確認
24感染価・ポテンシー試験
実際に感染し発現する力を測り、vg/IU比で製剤の品質と一貫性を示す必須項目
- 基準の方法
- 感染価：TCID50 / qPCR・ddPCRエンドポイント法（感染後ゲノムコピー測定）
- 試薬・資材
- HeLaRC32細胞野生型アデノウイルス5型ターゲット特異的TaqManプライマー/プローブAAV2リファレンススタンダード
- 代表的なメーカー
- Bio-RadMolecular DevicesATCCBDApplied Biosystems
- ほかの方法
- ddPCRエンドポイントTCID50・相対感染力アッセイ・細胞ベース発現ポテンシー
25複製能AAV(rcAAV)検出
複製能を持つAAVの混入は患者安全に直結するためFDA等が必須とする安全性試験だから
- 基準の方法
- 許容細胞（HeLa/HEK293系）にヘルパーアデノウイルス存在下で検体を接種し、継代で増幅したのち rep／cap 特異的qPCRで検出する
- 装置
- Applied Biosystems QuantStudio 7 Pro リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher）。継代培養用CO2インキュベータ（Thermo Heracell VIOS）。
- 試薬・資材
- TaqMan rep／cap特異的プライマー・プローブ、ヘルパーアデノウイルス、許容細胞株（HeLa/HEK293系）、TaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher）。
- 代表的なメーカー
- Bio-RadThermo FisherApplied Biosystems
- ほかの方法
- ddPCRによるrep/cap絶対定量・感染価ベースrcAAV機能アッセイ
26凝集体・粒子径評価／SEC-MALS
SEC-MALSで単量体・二量体・凝集体を分け定量、凝集が効果と免疫・安全性に直結
- 基準の方法
- SEC-MALS（サイズ排除クロマトグラフィー＋多角度光散乱）
- 装置
- MALS検出器（多角度光散乱）示差屈折率（dRI）検出器UV検出器HPLC（SECカラム）
- 試薬・資材
- 水系緩衝液（PBS等の移動相）
- ほかの方法
- DLS／MADLS・SV-AUC・マスフォトメトリー
27粒子数・サブビジブル管理
SEC-MALSで絶対粒子数を、光遮蔽法でサブビジブルをUSP規格に対し同時に管理する
- 基準の方法
- SEC-MALS（凝集体・分子量・粒子数推算の別の方法）
- 装置
- SEC-MALS（多角度光散乱検出器）dRI（示差屈折率検出器）UV検出器液中パーティクルカウンター（サブビジブル）
- 試薬・資材
- 水系緩衝液移動相粒径校正用標準ビーズ
- ほかの方法
- NTA・フローイメージング顕微鏡（FIM）・DLS/MADLS物理力価
28封入不純物DNA定量
DNase耐性の封入DNAをqPCRで定量、外側分解できず投与されるため安全性CQAとなる
- 基準の方法
- DNase処理後の qPCR / ddPCR による封入DNA定量
- 試薬・資材
- ベンゾナーゼ宿主細胞ゲノムDNA標準宿主反復配列アンプリコン用プライマー/プローブプラスミド/ヘルパー特異プローブ
- ほかの方法
- ddPCRによる封入HCDNA絶対定量・NGSによる封入混入DNA・市販HCDNA残存定量キット
29残存宿主由来不純物：DNA/HCP
残存host DNA・プラスミド・HCPを定量し発がん・免疫リスクをFDA/WHO規格内に抑える
- 基準の方法
- 残存宿主細胞DNA
- 試薬・資材
- ゲノムDNA標準（HEK293）残存DNA定量用プライマー／プローブDNase I抗HCPポリクローナル抗体
- ほかの方法
- 蛍光色素（PicoGreen系）総DNA・質量分析プロテオミクス・デジタル/qPCR残存プラスミド・アデノヘルパー
30残存プラスミドDNA定量
封入・遊離した残存プラスミドは宿主DNAと別に管理すべき製造由来の遺伝毒性不純物だから
- 基準の方法
- DNase処理の有無を比較したqPCR／ddPCRでカプシド内封入プラスミドと遊離プラスミドを区別し、rep・cap・KanR等を標的に定量する
- 装置
- Bio-Rad QX600 Droplet Digital PCR System（DNase処理±比較で封入/遊離プラスミドを区別）。
- 試薬・資材
- rep／cap／カナマイシン耐性遺伝子特異的プライマー・プローブ、Bio-Rad ddPCR Supermix for Probes、Merck Benzonase／DNase I（遊離プラスミド除去）。
- ほかの方法
- リアルタイムqPCR・NGSによる封入核酸不純物プロファイリング
29工程を選んでいます。仕様メモでは、宛先・条件・確認したいことを書き足して、PDF やメールで渡せます。
選んだ29工程で仕様メモを作る公開情報にもとづく一般的な整理です。基準の方法とメーカーは代表例で、推薦ではありません。実際に要る工程と装置は、規模と規制の方針で変わります。