微生物・発酵（酵母）の工程チェックリスト
検討する工程に印を付けて、規模と用途を書けば、仕様メモにして代理店やメーカーへ渡せます。工程ごとの詳しい説明は工程マップにあります。
2規模と用途
3検討する工程に印を付ける19 / 19 工程
培養・産生
1宿主株・セルバンクの構築と品質管理
全生産の出発点を1本に固定し、株の同一性・コピー数・継代安定性でロット間のぶれを断つ工程。
- 基準の方法
- マスター/ワーキングセルバンク方式（2段バンク）＋株の同一性・純度・遺伝的安定性試験
- 試薬・資材
- 微生物 MCB/WCB作製・保管受託（大腸菌・酵母・糸状菌）選択用抗生物質（カナマイシン・アンピシリン等）DNA/RNA抽出装置酵母 発酵培養用培地（Pichia／Saccharomyces）
- ほかの方法
- 全ゲノムシーケンス(WGS)による株同定・変異監視・フローサイトメトリーによる単クローン性・生存率確認・プラスミド/エピソーム保持率測定(抗生物質非添加比較)
2種培養・スケールアップ
バンク1本を本タンクへ直投できず、段階増菌と無菌確認で本発酵の均一な開始を担保する工程。
- 基準の方法
- 段階的シードトレイン
- ほかの方法
- N-1パーフュージョンによる高密度シード化・凍結シード(クライオバッグ)直接投入
3本培養・フェドバッチ
超高密度培養とメタノール誘導で発現・分泌を制御し、収量を決める中心工程。
- 基準の方法
- 流加培養（フェドバッチ）
- 試薬・資材
- 発酵用炭素源・誘導物質（グリセロール・メタノール・グルコース等バルク原料）酵母 発酵培養用培地（Pichia／Saccharomyces）消泡剤（アンチフォーム）pH調整システム（自動pH制御）
- ほかの方法
- メタノールフリー誘導(GAP等構成的・代替プロモーター)・S. cerevisiae ガラクトース誘導(GAL系)・連続/灌流発酵による生産性向上
4工程内分析・IPC
菌量・基質残存・力価を随時測り、誘導タイミングと供給速度の誤りを運転中に正す工程。
- 基準の方法
- オフライン分析
- ほかの方法
- インライン・ラマン/近赤外による基質・菌量リアルタイム推定・キャピラリーバイオセンサー/酵素電極でのメタノール・グルコース測定
回収・清澄化
5細胞分離・清澄化（ハーベスト）
上清側の分泌物を回収するため菌体・細胞片を除き、後段クロマトの目詰まりを防ぐ前処理。
- 基準の方法
- ディスクスタック遠心分離＋デプスろ過による一次清澄化（分泌生産＝上清回収）
- ほかの方法
- TFF/MF(精密ろ過)またはホロファイバーによる清澄化・凝集・フロキュレーション前処理＋デプスろ過
6封入体洗浄
封入体表面の宿主由来夾雑を洗浄除去し、可溶化・巻き戻しの純度と再現性を確保するため
- 基準の方法
- 遠心でIBを回収後、0.5% Triton X-100・1〜2 M尿素・EDTA含有Tris緩衝液で複数回の段階洗浄を行い、各回遠心でペレットを回収する
- ほかの方法
- クロスフロー(TFF)によるIB洗浄・濃縮とバッファー置換・低圧反復ホモジナイズ＋洗浄で未破砕菌体を低減
7ホモジナイズ破砕
非分泌・封入体型で頑丈な酵母細胞壁を物理破砕し、菌体内の目的物を取り出す補助経路。
- 基準の方法
- 高圧ホモジナイズによる機械的破砕＋遠心/ろ過で可溶画分を分離
- ほかの方法
- ビーズミル破砕・酵素的細胞壁溶解(ザイモリアーゼ/リチカーゼ)
8リフォールディング
封入体由来の変性タンパクを天然立体構造・正しいジスルフィド結合へ再生し活性を回復するため
- 基準の方法
- 可溶化液から還元剤を除き、酸化還元対（システイン／シスチンなど）を含むリフォールディング液へ希釈する
- ほかの方法
- オンカラム・リフォールディング(固定化タンパクをカラム上で巻戻し)・パルス希釈/段階透析による緩やかな変性剤除去
精製
9キャプチャー
汎用アフィニティ配位子が無いためタグ精製かイオン交換で一気に捕捉し、大半の不純物を落とす土台工程。
- 基準の方法
- アフィニティ
- ほかの方法
- マルチモーダル(混合モード)クロマトでの捕捉・拡張床吸着(EBA)で清澄化と捕捉を一体化・標的特異的アフィニティ(抗体・基質アナログ・タグ)
10中間精製・ポリッシング
別の原理のIEXとHICで凝集体・残存宿主タンパク・分子変異体を削り規格純度まで磨く工程。
- 基準の方法
- イオン交換
- ほかの方法
- SEC(ゲルろ過)による最終ポリッシング・マルチモーダルAEX/CEXでの磨き込み・膜クロマト(フロースルーAEX膜)
11ウイルスクリアランス
ウイルスリスクは低いが工程由来不純物とバイオバーデンを確実に減らしクリアランスを担保する工程。
- 基準の方法
- ナノ/除菌ろ過＋クロマト各段でのクリアランス、エンドトキシン・DNA除去工程の組込み
- 代表的なメーカー
- MerckSartoriusPallAsahi Kasei
- ほかの方法
- 低pH/界面活性剤処理などウイルス不活化工程の追加・クロマト工程のクリアランス評価(スパイク試験)
製剤・充填
12限外ろ過/透析ろ過
希薄な精製液をTFFで濃縮し最終製剤バッファーへ置換、安定性と投与濃度を両立させる工程。
- 基準の方法
- タンジェンシャルフローろ過（TFF）によるUF/DF（濃縮＋ダイアフィルトレーション）
- ほかの方法
- シングルユース・プリサニタイズドTFFアセンブリ・透析/ゲルろ過によるバッファー置換
13除菌ろ過・無菌充填
0.2µm除菌ろ過とGrade A無菌充填で製品の無菌性を確保する患者安全の最終関門。
- 基準の方法
- 0.2 µm除菌ろ過＋無菌充填（Grade A環境）、容器栓完全性確認
- 試薬・資材
- 注射用水（WFI）・精製水製造装置
- ほかの方法
- 凍結乾燥(リオフィライズ)製剤化・原薬(DS)凍結保管→後日DP充填の分離運用
品質特性・分析
14同一性・一次構造確認
インタクト質量とペプチドマッピングで狙ったタンパク質か分子レベルに確認し取り違え・変異を防ぐ工程。
- 基準の方法
- LC-MSによるインタクト質量測定＋トリプシン消化ペプチドマッピング
- 試薬・資材
- ペプチドマッピング用プロテアーゼ・消化酵素（MSグレード）還元剤・アルキル化剤（DTT／TCEP／IAA・分析グレード）HPLC／UHPLC・LC-MS用移動相溶媒（グラジエントグレード）分析用酵素（IdeS／IgdE／PNGase F・脱グリコシル化／サブユニット切断）
- ほかの方法
- N末端アミノ酸配列分析(エドマン分解)・ウエスタンブロット/イムノアッセイによる同定
15純度・不均一性
サイズ変異と電荷変異を分けて定量し純度プロファイルが規格内かを判定する安全性・有効性直結の試験。
- 基準の方法
- CE-SDS
- ほかの方法
- SDS-PAGE(クマシー/銀染色)・SEC-MALSによる絶対分子量・凝集体定量・分析超遠心(AUC)による凝集体別法での確認
16糖鎖プロファイル
酵母特有のハイパーマンノシル化が免疫原性に影響するため放出糖鎖をロット間で監視する工程。
- 基準の方法
- PNGase Fで遊離した糖鎖を蛍光標識
- 試薬・資材
- N型糖鎖蛍光標識・遊離キット（RapiFluor-MS／2-AB）分析用酵素（IdeS／IgdE／PNGase F・脱グリコシル化／サブユニット切断）HPLC／UHPLC・LC-MS用移動相溶媒（グラジエントグレード）
- ほかの方法
- 単糖組成分析(HPAEC-PAD)・エキソグリコシダーゼ逐次消化による構造帰属・グライコ改変株(ヒト型糖鎖化)由来糖鎖のMS確認
17工程由来不純物
残存する酵母HCP・DNAを微量まで検出し許容レベル以下に下げ切ったか確認する安全性中核試験。
- 基準の方法
- 酵母特異的HCP ELISA（サンドイッチ法）＋残存DNAのqPCR定量
- ほかの方法
- LC-MS/MS(DIA等)による個別HCP同定・定量・閾値法/蛍光色素法による残存DNA総量測定・2D-DIGE/抗体カバレッジ評価でHCP ELISAの妥当性確認
18力価・含量
標準品対比のバイオアッセイと含量測定で効くか・どれだけ入るかを保証する有効性の規格。
- 基準の方法
- 標準品対比のバイオアッセイ
- ほかの方法
- ELISA/SPRによる結合活性ベースの力価測定・BCA/Bradford比色法によるタンパク質定量・アミノ酸分析による絶対含量
19エンドトキシン・無菌
注射剤としてエンドトキシン・微生物の不在を薬局方法で確認する患者安全の最終関門。
- 基準の方法
- バクテリアルエンドトキシン試験（LAL
- 試薬・資材
- バイオバーデン試験（微生物数定量）
- ほかの方法
- 組換えファクターC(rFC)法によるエンドトキシン測定・迅速微生物迅速法(成長ベース蛍光/ATP)でのバイオバーデン・モノサイト活性化試験(MAT)による発熱性評価
19工程を選んでいます。仕様メモでは、宛先・条件・確認したいことを書き足して、PDF やメールで渡せます。
選んだ19工程で仕様メモを作る公開情報にもとづく一般的な整理です。基準の方法とメーカーは代表例で、推薦ではありません。実際に要る工程と装置は、規模と規制の方針で変わります。