AAVの製造では、細胞をMCB（マスター）とWCB（ワーキング）の2段で保存しておき、製造のたびにWCBから細胞を取り出して使う。再現性のある製造には、3つが要る。バイアルを均一に分注すること、ゆっくり凍らせて細胞を傷めないこと、超低温で長く安定に保つこと。凍結はDMSOを最終10%加えて毎分約1℃でゆっくり下げ、保管は液体窒素の気相（おおむね −130〜−150℃）で行う。

セルバンク（MCB／WCB）が製造に使えると裏づけるには、確かめることが2つあります。1つは「きれいさ」で、宿主以外のものが入り込んでいないか、外から来たウイルスが混じっていないかを見ます。もう1つは「同一性」で、その細胞が確かに目的の細胞株であることを確かめます。これは ICH Q5D が求めている考え方です。AAV のような遺伝子治療用ベクターをつくるときは、HEK293 という細胞でベクターを産生します。この細胞バンクには、無菌・マイコプラズマ・同定・外来性ウイルス・遺伝的安定性の試験が規制要件として課されます。それぞれの試験の中身は、ICH Q5A(R2)・Q5B と各国の薬局方（米国・欧州・日本）にそって決まります。

AAV製造で使う生産細胞は、浮遊状態で育つように馴らしたHEK293細胞です。アデノウイルス由来のE1領域を組み込んであり、ウイルス産生を支えます。この細胞に遺伝子を導入する操作（トランスフェクション）の直前には、3つの状態をそろえておく必要があります。細胞がよく生きていること、狙った濃さ（密度）になっていること、若すぎず老けすぎない適切な細胞齢であることです。この状態でN生産槽へ細胞を送り込むため、種となる細胞を少しずつ増やしていきます。具体的にはシェイクフラスコから始めて、小型バイオリアクター、シングルユースバイオリアクター（SUB）へと段階的に器を大きくしていくのが基準のやり方です。容器を大きくしても培養環境がぶれないよう、単位容積あたりの撹拌動力（P/V）を各段階で一定に保つなど、装置の形をそろえながら拡大する作法が確立しています。

産生プラットフォームをどれにするかは、アップストリームの最初の大きな分かれ道になる。ここでの選択が、その先の工程をまとめて決めてしまうからだ。具体的には、精製の設計（空カプシドと実カプシドの比率、宿主由来の不純物プロファイル）、収量とCOGS（製造コスト）、そして規制当局への説明（製造由来の不純物やトランスフェクション試薬をどう管理するか）が、すべてこの一手に引きずられる。 臨床でも商業でも最も広く使われているのは、次のやり方だ。まず浮遊馴化させたHEK293細胞を、シングルユースの撹拌槽バイオリアクター（STR）でN-1からNへと拡大する。そのうえで3種類のプラスミドを一過性にトランスフェクションし、AAVを産生する。 このやり方には、接着系と比べてはっきりした利点がある。血清フリーの浮遊培養とPEI系試薬による一過性発現を組み合わせると、スケールに依存せず、スケールアップしやすく、閉鎖系でGMPにも適合する。だからこそ、シングルユースSTRが今の標準フォーマットになっている。 実務の流れとしては、臨床・商用で実績のあるこの方式をまず基準法に据える。そのうえで、収量・コスト・必要なスケールに応じて、代替手段を検討していく。

AAVを一過性に産生するときは、必要な情報を3つのプラスミドに分けて、浮遊培養したHEK293細胞へ同時に入れる。1つ目はpITR（cis）で、ITRで挟んだ導入遺伝子を運ぶ。2つ目はpRepCap（trans）で、RepとCapを供給する。3つ目はpHelperで、アデノウイルス由来のヘルパー遺伝子を補う。この導入がうまくいくかどうかは、効率・再現性・スケールのしやすさ・GMPへの適合という4点に表れ、それがそのままベクターの収量と、中身の入った粒子と空の粒子の比（空実比）を左右する。だから、どのトランスフェクション試薬を使い、どう複合体をつくるかを決めることが、この工程の中心になる。臨床や商用の製造では、カチオン性高分子であるPEIを使い、脂質に頼らずに沈殿させて細胞に入れる方法が基準法として定着している。安価で、スケールを問わず使え、GMPグレードの原料が手に入りやすいためである。

HEK293細胞にプラスミドを3種同時に入れて（トリプルトランスフェクション）rAAVをつくると、できたウイルスの大半は細胞の外に出ず、細胞の中にたまります。だから培養が終わったら、まず細胞を壊してベクターを外に取り出す必要があります。この溶解（ライセート化）が、後ろに続く清澄化や捕捉の前提になります。しかも溶解のやり方しだいで、その後のヌクレアーゼ処理やデプスろ過にかかる負荷が変わり、最終的なAAVの回収率も上下します。つまりこの工程は、全体の出来を左右する律速点（処理速度のボトルネック）になっているわけです。そのため現場では、界面活性剤を使って化学的に細胞を溶かす方法が基準として選ばれています。

細胞を溶かすと、宿主細胞のゲノムDNAが大量に放出されます。このDNAのせいで液の粘り気が増し、凝集体もできて、フィルターや精製樹脂（クロマト樹脂）を詰まらせてしまいます。そこでまず、ヌクレアーゼという酵素でDNAを細かく切り、粘り気を下げます。続いて2段のデプスろ過にかけ、細胞やデブリ（細胞の断片）、コロイドを取り除きます。この一連の前処理は、目的のウイルスを捕まえる捕捉クロマト（AAVXアフィニティ）の前に欠かせない工程で、ここのできばえが回収率とその後の処理のしやすさを左右します。

AAV産生バルクのなかで、目的のAAVカプシドはごく微量しか含まれていません。そのまわりには、HEK293細胞に由来する宿主細胞タンパク質（HCP）やDNA、Pluronicや培地成分、空カプシドの前駆物などが大量に混ざっています。アフィニティ捕捉は、AAVカプシドの立体構造（コンフォメーション）と保存ループを狙って認識します。そのため一度通すだけで純度90%超に届き、回収率も高く（多くの場合70〜80%超）保てます。結果として、後段で空カプシドと実カプシドを分ける陰イオン交換や、濃縮を担うTFFにかかる負荷が大きく下がります。こうした効きの良さから、アフィニティ捕捉は臨床AAVプロセスの一次捕捉（キャプチャー）の基準法として定着しています。

フルキャプシドと空キャプシドの違いは、内包したゲノムDNAがもたらすごくわずかな負電荷の差にすぎません。そこでこの電荷差をそのまま分離に使えるのが、陰イオン交換(AEX)クロマトグラフィーです。塩濃度を少しずつ上げる高分解能のグラジエント溶出を組み合わせると、両者をいちばん素直に見分けられるため、製造現場の基準法として定着しています。手順としては、まずpH8.5〜9でキャプシドの表面を負に帯電させてQ系リガンドに結合させ、そのうえで塩濃度を徐々に高めていきます。すると電荷の弱い空キャプシドが先に外れ、続いて目的の実キャプシドが溶出します。

精製したAAV（直径約25 nm）を、目的の濃度まで濃くしてから製剤バッファに置き換える工程です。ここで使うのが限外ろ過（UF/DF、タンジェンシャルフローろ過）で、AAVは膜の細孔より十分大きいため膜を通り抜けません。そのため、水や低分子は膜から逃がしつつ、AAVだけを膜の上に残せます。この性質を利用すると、濃縮とバッファ置換（ダイアフィルトレーション）を一度に進められるので、これが基準法になっています。最後に0.2/0.22 µmの除菌グレードフィルターでろ過して、菌などのバイオバーデンを取り除きます。この最終ろ過まで終えたものを原薬／原液とし、各国薬局方が定める無菌製剤の要件にも沿った標準工程です。

AAV原薬は、有効成分の濃度がとても低い（多くは0.01〜0.1mg/mL）。そのため、フィルター膜やチューブ、容器の表面にカプシドが吸着しただけでも、力価の30〜40%が失われると報告されている。最終工程の除菌ろ過は、無菌性を確保するために欠かせない。ただし、このロスをどう抑えるかが成否を分けるため、ろ過の基準法をどう選ぶかが重要になる。

AAVカプシドは、濃度が低い場面でやっかいな性質を見せます。容器の壁やチューブ、フィルターの表面に吸着してしまい、ベクター粒子が最大90%も失われ、ゲノム力価もばらつくのです。さらに血清型によっては、粒子どうしが凝集します。こうした損失や凝集をどう抑えるかが、処方設計の勘どころになります。承認済みのAAV製剤がその答えを示しています。Zolgensmaは20mM Tris（pH8.0）に200mM NaClと1mM MgCl2、そして0.005%のポロキサマー188を、Luxturnaは10mMリン酸（pH7.3）に180mM NaClと0.001%のポロキサマー188を配合しています。どちらも、非イオン界面活性剤であるポロキサマー188を標準で加え、高いイオン強度（200mM相当以上）とカプシドを守る糖を組み合わせて、凝集と吸着を抑えています。これが現場の基準法です。

AAVのカプシド（ウイルスの殻）は、氷と水のさかいめや空気と液のさかいめに触れると壊れやすくなります。凍らせるときに溶けていた成分が再び結晶化すると、そこでも力がかかります。こうした機械的なストレスで、カプシドは破れたり、くっつき合って固まったり、容器の表面に吸い付いて回収できなくなったりします。これを防ぐ条件はほぼ決まっていて、マイナス60℃以下まで深く冷やして保つことに、界面活性剤・糖・中身が吸着しにくい容器を組み合わせます。活性を保ったまま長く安定させる基準として確立しており、市販されているAAV製剤のLuxturnaやZolgensmaも同じ設計を採っています。

AAVは輸送中に温度が崩れると壊れやすい。深冷の温度帯から外れたり、凍結と融解を繰り返したりすると、カプシドが破裂し、凝集が起こり、力価が下がる。だから出荷から投与までの全行程で温度を保証する必要があり、マイナス60℃以下（または冷蔵）をバリデート済みのコールドチェーンで維持することが必須になる。実際、市販のAAV製品はドライアイスやクライオシッパーを使い、凍結したまま出荷されている。

用量を vg/dose で決めるときの一次規格になる工程です。ここで測ったゲノム量が、感染価との比（vg/IU）や空・実比を出すときの分母になり、すべての CQA の起点になります。投与量を決め、full:empty 比の分子（詰まっているゲノム量）を決め、さらにロットごとに用量がそろっているかの根拠にもなります。

投与する粒子の総数と、免疫原性に関わる空キャプシドの割合を押さえるための工程です。さらにvg/cp比（ゲノムが充填された効率）として表すことで、製品品質を左右する重要な指標（CQA）になります。

治療用ゲノムをちゃんと封入できた実カプシドの割合は、品質を左右する。これで力価が決まり、用量設計の土台になり、安全性にも直結するからだ。だからこの割合は、規制当局への提出でも必ず示すよう求められる重要品質特性（CQA）になっている。

封入されたゲノムが部分的だったり、途中で切れていたりすると、導入遺伝子がうまく発現しないことがあります。こうした切れたゲノム（切断種）は、免疫反応を引き起こすリスクにもつながります。だからゲノムの全長性は、力価と安全性の両方を左右する重要な品質特性（CQA）として、しっかり評価します。

VP比は、重要な品質特性のひとつです。ウイルスの殻（カプシド）がきちんと組み上がるかどうかに関わり、感染やトランスダクションの効率にも効いてきます。だからこそ、ロットごとのばらつきを見張る目安になり、製造プロセスがうまく回っているかを知る指標にもなります。

カプシドタンパク質（VP）の同一性確認とPTM特性解析が必要なのは、2つの理由からです。1つは、設計したとおりの血清型のVP配列になっているかを確かめたいから。もう1つは、脱アミド化・酸化・アセチル化・リン酸化といった翻訳後修飾（PTM）が、ベクターの導入効率や感染価に影響することがあるからです。そこで、まず配列の同一性を確認し、そのうえでどこにどんなPTMが入っているかをプロファイリングします。

「実際に細胞へ感染して効くか」を確かめる項目です。規制でも必須とされています。あわせて、ゲノムを持つウイルス粒子の数(vg)に対して、本当に感染できる粒子(IU)がどれだけあるかの比をみて、製剤の品質と一貫性を示します。

凝集はAAVの効き目、免疫を呼び起こすリスク、安全性のすべてに直接かかわります。だからこそ正確に測りたいわけですが、ここで使うのが、いったん大きさで分けてから測るMALS法です。この方法なら、モノマー（単量体）、二量体、凝集体をそれぞれ切り分けて量を出せます。

粒子の数（濃度）は、ベクターをどれだけ投与するかを決める基準になります。さらに注射剤では、目に見えない不溶性微粒子（サブビジブル）の量をUSP規格で抑えるよう求められます。だから、この2つをあわせて測ります。

カプシドの中に取り込まれてしまったDNAは、ヌクレアーゼで処理しても外側から分解することができません。そのまま患者に投与されることになるので、安全性を左右する重要な品質特性(CQA)として扱われます。だからこそ規制でも管理が求められています。具体的には、カプシドに包まれていない遊離DNAは1回投与あたり10ng未満に抑え、断片の長さもおおよそ200塩基対(bp)以下にすることが目安とされています。

残った宿主由来の不純物は、安全性を左右する重要な品質特性です。具体的には、宿主細胞のDNA、プラスミドやヘルパー由来の配列、宿主細胞のタンパク質（HCP）が当たります。これらは発がん性や免疫原性のリスクにつながるため、ていねいに取り除いたうえで、FDAとWHOの定める規格を満たしていることを示します。たとえば、遊離した残存DNAは1回投与あたり10ナノグラム未満に、断片の長さはおよそ200塩基対以下に抑えます。